Том временем боевая организация эсеров приговорила великого князя Сергея Александровича к смерти. Ее агенты следили за ним, выжидая удобного случая, чтобы совершить казнь. Елисавета Феодоровна знала, что супругу угрожает смертельная опасность. В анонимных письмах ее предупреждали, чтобы она не сопровождала своего мужа, если не хочет разделить его участь. Великая княгиня тем более старалась не оставлять его одного и, по возможности, повсюду сопровождала супруга.

5 (18) февраля 1905 года Сергей Александрович был убит бомбой, брошенной террористом Иваном Каляевым. Когда Елисавета Феодоровна прибыла к месту взрыва, там уже собралась толпа. Кто-то попытался помешать ей подойти к останкам супруга, но она своими руками собрала на носилки разбросанные взрывом куски тела мужа. После первой панихиды в Чудовом монастыре Елисавета Феодоровна возвратилась во дворец, переоделась в черное траурное платье и начала писать телеграммы, и прежде всего — сестре Александре Феодоровне, прося ее не приезжать на похороны, т.к. террористы могли использовать их для покушения на императорскую чету. Когда великая княгиня писала телеграммы, она несколько раз справлялась о состоянии раненного кучера Сергея Александровича. Ей сказали, что положение кучера безнадежно и он может скоро умереть. Чтобы не огорчить умирающего, Елисавета Феодоровна сняла с себя траурное платье, надела то же самое голубое, в котором была до этого, и поехала в госпиталь. Там, склонившись над постелью умирающего, она, пересилив себя, улыбнулась ему ласково и сказала: «Он направил меня к вам». Успокоенный ее словами, думая, что Сергей Александрович жив, преданный кучер Ефим скончался в ту же ночь.

На третий день после смерти мужа Елисавета Феодоровна поехала в тюрьму, где содержался убийца. Каляев сказал: «Я не хотел убивать вас, я видел его несколько раз и то время, когда имел бомбу наготове, но вы были с ним, и я не решился его тронуть».

- «И вы не сообразили того, что вы убили меня вместе с ним?» — ответила она. Далее она сказала, что принесла прощение от Сергея Александровича и просила его покаяться. Но он отказался. Все же Елисавета Феодоровна оставила в камере Евангелие и маленькую иконку, надеясь на чудо. Выходя из тюрьмы, она сказала: «Моя попытка оказалась безрезультатной, хотя, кто знает, возможно, что в последнюю минуту он осознает свой грех и раскается в нем». Великая княгиня просила императора Николая II о помиловании Каляева, но это прошение было отклонено.

Из великих князей на погребении присутствовали только Константин Константинович (К.Р.) и Павел Александрович. Погребли его в маленькой церкви Чудова монастыря, где ежедневно в течении сорока дней совершались заупокойные панихиды; великая княгиня присутствовала на каждой службе и часто приходила сюда ночью, молясь о новопреставленном. Здесь она почувствовала благодатную помощь и укрепление от святых мощей святителя Алексия, митрополита Московского, которого с тех пор особо почитала. Великая Княгини носила серебряный крестик с частицей мощей святителя Алексия. Она считала, что святитель Алексий вложил в ее сердце желание посвятить Богу всю оставшуюся жизнь.

На место убийства мужа Елисавета Феодоровна воздвигла памятник — крест по проекту художника Васнецова. На памятнике были написаны слова Спасителя со Креста: «Отче, отпусти им, не ведят бо что творят».

С момента кончины супруга Елисавета Феодоровна не снимала траур, стала держать строгий пост, много молилась. Ее спальня в Николаевском дворце стала напоминать монашескую келью. Вся роскошная мебель была вынесена, стены перекрашены в белый цвет, на них находились только иконы и картины духовного содержания. На светских приемах она не появлялась. Бывала только в храме на бракосочетаниях или крестинах родственников и друзей и сразу уходила домой или по делам. Теперь ее ничто не связывало со светской жизнью.

Она собрала все свои драгоценности, часть отдала казне, часть — родственникам, а остальное решила употребить на постройку обители милосердия. На Большой Ордынке в Москве Елисавета Феодоровна приобрела усадьбу с четырьмя домами и садом. В самом большом двухэтажном доме расположились столовая для сестер, кухня и другие хозяйственные помещения, во втором — церковь и больница, рядом — аптека и амбулатория для приходящих больных. В четвертом доме находилась квартира для священника — духовника обители, классы школы для девочек приюта и библиотека.

10 февраля 1909 года великая княгиня, собрала 17 сестер основанной ею обители, сняла траурное платье, облачилась в монашеское одеяние и сказала: «Я оставлю блестящий мир, где я занимала блестящее положение, но вместе со всеми вами я восхожу в более великий мир — в мир бедных и страдающих».

Первый храм обители («больничный») был освящен епископом Трифоном 9 (21) сентября 1909 г. (в день празднования Рождества Пресвятой Богородицы) во имя святых жен-мироносиц Марфы и Марии. Второй храм — в честь Покрова Пресвятой Богородицы, освящен в 1911 году (архитектор А.В. Щусев, росписи М.В. Нестерова). Построенный по образцам новгородско-псковского зодчества, он сохранял теплоту и уют небольших приходских церквей. Но, тем не менее, был рассчитан на присутствие более тысячи молящихся. М.В. Нестеров сказал об этом храме: «Храм Покрова — лучший из современных сооружений Москвы, могущий при иных условиях иметь помимо прямого назначения для прихода, назначение художественно-воспитательное для всей Москвы». В 1914 году под храмом была устроена церковь — усыпальница во имя Сил Небесных и Всех Святых, которую настоятельница предполагала сделать местом своего упокоения. Роспись усыпальницы сделал П.Д. Корин, ученик М.В. Нестерова.