Обвинитель докладывал суду о пересылке игуменом неких посланий и пороха казакам Богдана. Преподобный опротестовал это заявление, потребовав предоставления свидетельских показаний со стороны обвинения. Обыск, проведенный в монастыре, не дал результатов. Когда об этом было доложено инспектору-обвинителю, тот в сердцах проговорился: «Ей же, чтоб вас поубивало, что не подбросили какого ворка пороха и не сказали, будто здесь у чернецов нашли!» Впрочем, неспособные доказать собственную клевету, обвинители выдвинули другое, главное свое обвинение, и по нему решили, наконец, расправиться с праведником, который «унию святую оскорблял и проклинал».

Понимая, что ищут лишь повода к его убийству, преподобный Афанасий заявил судьям: «Затем ли, милостивые Панове, приказали мне в себя придти, что я оскорблял и проклинал унию вашу? — Так я на сейме в Варшаве пред королем... и сенатом его пресветлым говорил и всегда всюду говорил по воле Божией. И перед вами теперь утверждаю: проклята уния ваша...»

После недолгого совещания судьи объявили игумена заслуживающим смертной казни. До получения из Варшавы окончательной санкции преподобный Афанасий, закованный в колодки, был посажен в цейхгауз. Когда же в Брест приехал католический луцкий бискуп Гембицкий и канцлер Литовского княжества Альбрехт Радзивилл, не сломленный игумен и в их присутствии заявил, что уния проклята Богом. На это бискуп ответил: «Будешь язык свой завтра перед собой в руках палача видеть!»

В ночь на 5 сентября в камеру Афанасия был послан студент-иезуит, чтобы сделать последнюю попытку склонить к измене Православию непоколебимого игумена. Попытка эта не имела успеха, и тогда с мученика сняли колодки и повели к брестскому воеводе Масальскому, который в раздражении бросил: «Имеете уже его в своих руках, делайте же с ним, что хотите!»

Из обоза воеводы гайдуки привели мученика в соседний бор у села Гершановичи, начали пытать его огнем принуждая отречься от Православия, а после приказали одному из них застрелить преподобного. Этот гайдук, который рассказал позже о гибели мученика людям, и среди них — автору повести об убиении преподобномученика, «видя, что это духовник и добрый его знакомый, сначала попросил у него прощения и благословения, а потом в лоб ему выстрелил и убил... покойный же, уже простреленный двумя пулями в лоб навылет, еще, опершись на сосну, стоял некоторое время в своей силе, так что приказали столкнуть его в ту яму. Но и там он сам повернулся лицом вверх, руки на груди накрест сложил и ноги вытянул...»

Лишь 1 мая, через восемь месяцу после этого злодейства какой-то мальчик семи или восьми лет показал симеоновской братии место, где лежало тело игумена. Земля в том месте не была освящена и принадлежала иезуитам. Монахи выкопали тело и, испросив позволения у полковника Фелициана Тышкевича, перенесли останки преподобномученика в монастырь, где погребли в храме Симеона Столпника «на правом клиросе в склепике».

Нетленные мощи игумена Афанасия, положенные в медной раке, привлекали множество богомольцев, так что и само существование монастыря, весьма бедного со дня его основания, поддерживалось преимущественно доходами от молебных песнопений у мощей, прославленных чудотворениями.

Уже спустя десять лет после мученической кончины Брестского игумена 5 января 1658 года Киево-Печерский архимандрит Иннокентий Гизель и Лещинский игумен Иосиф Нелюбович-Тукальский доложили царю Алексею Михайловичу, что над мощами преподобного мученика Афанасия неоднократно сиял чудесный свет.

Память о святом мученике с тех пор сохраняется в народной памяти. Вскоре после кончины было написано сказание о гибели его и сложено церковное песнопение в его честь; существует также тропарь и кондак, написанные архимандритом Маркианом 30 августа 1819 года. Когда было установлено официальное празднованне — неизвестно, однако Афанасий Брестский именуется преподобным мучеником, причисленным к лику киевских святых, еще в «Истории об унии» святителя Георгия Конисского.

8 ноября 1815 года при пожаре в Симеоновской церкви расплавилась медная рака с мощами святого Афанасия, и уже на следующий день священник Самуил Лисовский нашел частицы мощей мученика и положил их на оловянном блюде под алтарем монастырской трапезной церкви. В 1823 году при принятии церковного имущества новым настоятелем Автономом подлинность их была засвидетельствована присяжными показаниями семи брестских жителей, присутствовавших при собирании частиц мощей после пожара. Вскоре Минский архиепископ Антоний по просьбе Автонома распорядился «положить мощи в ковчег и хранить оные в церкви с благоприличием».